Auflösungsvermögen optischer Mikroskope I.

Hallo liebe Freunde der Mikrokristalle,

in meinem letzten Blogbeitrag war die Beugung von Lichtwellen das Thema, und wir haben die Auswirkung auf die Einstellung der Aperturblende am Mikroskop besprochen.

Heute geht es um die Frage, wie hoch ist das maximale Auflösungsvermögen eines Durchlichtmikroskops. Wir wandeln dabei ein wenig auf den Spuren Ernst Abbes, der sich grundlegende Gedanken zu diesem Thema gemacht hat. Wer in der Physik nicht ganz sattelfest ist, sollte vorher unbedingt meinen letzten Blogbeitrag zum Thema Beugung lesen. Die Begriffe Beugung und Interferenz sollten bekannt sein.

Hier noch einmal die Skizze aus meinem letzten Blogbeitrag: (Durch draufklicken kann man sie vergrössern).

Interferenz am Einzelspalt mit Verlauf der Intensität I. Minimum.

Interferenz am Einzelspalt mit Verlauf der Intensität I.

 

 

Wir sehen einen Spalt mit der Breite d. Lichtwellen mit der Wellenlänge λ laufen auf den Spalt zu. Auch am Spalt bilden sie, gemäss dem Huygensschen Prinzip neue Elementarwellen, die dann hinter dem Spalt neue Wellenfronten bilden. Diese sind hier aber nicht eingezeichnet. Statt dessen sehen wir einige Wellennormalen oder Wellenstrahlen. Sie geben eine ausgewählte Richtung a des Wellenverlaufs an. Die hier eingezeichneten Wellenstrahlen laufen auf einen fernen Punkt zu, der nicht eingezeichnet ist. Da der Punkt sehr weit entfernt ist, gegenüber der Breite des Spaltes, können wir die Wellenstrahlen parallel zeichnen. Alle von den roten Punkten ausgehende Elementarwellen starten zur gleichen Zeit. Die von Punkt 1 ausgehende Welle hat einen kürzeren Weg zum Ziel, als die von Punkt 5 ausgehende. Der Weg der von Punkt 5 ausgehenden Welle ist genau um die Wellenlänge λ länger. Nun kann man Wellenpaare finden, bei denen der  Weg der einen Welle gegenüber der anderen genau λ/2 länger ist. Das sind die Wellenpaare 1,3  2,4 und  3,5. Da diese Wellenpaare am Ziel einen Gangunterschied von λ/2 besitzen, löschen sie sich vollständig aus, da Wellenberg auf Wellental trifft. Also, alle Welle die in Richtung a mit einem Winkel ∝ gegenüber der Horizontale laufen, löschen sich gegenseitig aus. Physiker nennen das destruktive Interferenz.

Die Lichtwellen, die diesen Spalt passieren bilden ein Interferenzmuster, wie im letzten Blogbeitrag auch praktisch gezeigt wurde. Rechts in der Skizze sehen wir die Helligkeitsverteilung des Interferenzmusters, hier I genannt für Intensität. Wellenstrahlen die den Spalt ungebeugt passieren, bilden das Hauptmaximum 0. Ordnung. Das ist der dicke Bauch der Kurve und liegt auf der horizontalen Linie. Die in Richtung a laufenden Wellen mit dem Winkel ∝ löschen sich, wie beschrieben, alle durch destruktive Interferenz aus. Sie bilden das 1. Minimum des Beugungsbildes. (Links und rechts vom Intensitätsmaximum läuft die Kurve auf die Grundlinie zurück. (Dort ist es dunkel). Dort liegt also das 1. Beugungsminimum.

Aus der Skizze können wir ablesen:

sin ∝ = λ/d   (1)

Wellenstrahlen  mit dem Winkel ∝ löschen sich also durch destruktive Interferenz aus und bilden das Beugungsminimum 1. Ordnung. Man beachte, dass ∝ von der Spaltbreite d abhängt. Vergrößert sich die Spaltbreite d, verkleinert sich der Winkel ∝ bei unveränderter Wellenlänge λ.

Nach der kleinen Wiederholung begeben wir uns jetzt auf Ernst Abbes Spuren, der übrigens die folgenden Überlegungen vollständig ohne mathematische Formeln zu Papier gebracht hat. Stellen wir uns vor, wir hätten auf einem Objektträger eine sehr feine Struktur von Gitterlinien mit einer Spaltbreite x. (rote gestrichelte Linie). Das Licht unserer Beleuchtung möge die Wellenlänge λ besitzen. Wir wollen sie durch das Mikroskop mit Immersionsöl vom Brechungsindex nöl betrachten. Nehmen wir weiter an, wir könnten den Öffnungswinkel des Objektivs unseres Mikroskops verändern. (Solche Mikroskope gibt es).

Abbe hat nun experimentell festgestellt, dass man den Öffnungswinkel ∝1 des Objektivs so einstellen muss, dass sowohl das 0. Hauptmaximum als mindestens auch das 1. Beugungsminimum, beide hier durch die blauen Wellenstrahlen dargestellt, in das Objektiv fallen müssen. Dann und nur dann erhält man als Zwischenbild im Mikroskop ein strukturiertes Bild. Würde hier in der Skizze der Pfeil des 1. Beugungsminimums oberhalb der Linse verlaufen, käme kein Bild zustande, als Zwischenbild würde man nur einen hellen Fleck  sehen.

Gemäß Gl. (1) gilt für den Winkel des 1. Beugungsminimums als Sinus ausgedrückt:

sin ∝1 = λ/x   (2)

Die Wellenlänge λ verändert sich durch das Immersionsöl gemäß dem Brechungsgesetz in

λ′ = λ / nöl    (3)      nöl = Brechungsindex Öl

Aus Gl. (2) wird dann

sin ∝1 = λ′/x   (4)

Ernst Abbe hat den Begriff der Numerischen Apertur eingeführt. Mit der folgenden Skizze soll der Begriff erläutert werden:

Die Linse in der Skizze hat den Radius R. Die Gegenstandsweite beträgt a. Das daraus konstruierte Dreieck bildet einen Winkel, der Sigma genannt wird. Multipliziert man den Sinus des Winkels  mit dem Brechungsindex des Mediums zwischen Objektträger und Objektiv erhält man die Numerische Apertur des Objektivs. Dieser Wert ist meist im Objektiv des Mikroskops eingraviert.

NA = sin σ • nöl  (5)

Damit wir im Mikroskop ein strukturiertes Bild erhalten, ist es notwendig, dass sin σ und sin ∝1  gleich sind. Wir können daher schreiben:

NA = λ′/x • nöl   (6)

Für λ′ können wir gemäß Gl.(3) schreiben:

NA = ( λ/nöl)/ x • nöl    (7)

nöl können wir herauskürzen und erhalten:

NA = λ /x   (8)

Umgestellt nach x:

x = λ/NA   (9)

x ist also der kleinste Abstand zwischen 2 Punkten, den ein Mikroskop, abhängig von der numerischen Apertur des Objektivs noch auflösen kann. Besser schreibt man:

x ≥ λ/NA    (10)

Je größer die numerische Apertur des Objektivs ist, umso feinere Strukturen kann man abbilden. Blaues Licht ist kurzwelliger als rotes, darum kann man mit einem Blaufilter ebenfalls etwas feinere Strukturen voneinander unterscheiden.

Die hergeleitete Formel gilt für geradlinige Beleuchtung. Verwendet man schräge Beleuchtung, kann man in den Nenner noch eine 2 schreiben.

Für Berechnungen muss man beachten, dass der Winkel σ  der halbe Öffnungswinkel eines mikroskopischen Objektivs ist. Technisch gut realisierbar sind Öffnungswinkel von ca. 112°. Bei der Verwendung von Immersionsöl mit einem Brechungsindex von 1,5 erreicht man gemäß Gl.(5) eine numerische Apertur von

NA = sin (112°/2) • 1,5 = 1,24

Spitzenobjektive wie das Zeiss Plan Fluar 100x/1,45 Öl  besitzen eine NA = 1,45 und das Olympus Apo 100x/1,65Öl kann einen Wert von NA = 1,65 aufweisen.  Das sind ausgesprochene Spitzenwerte.

Für weiter Berechnungen muss man sich noch auf eine Wellenlänge einigen. Üblich ist λ = 550 nm zu wählen.

Mein Objektiv 100x  ist beschriftet mit: Plan100/1,25 Oil. Für dieses Objektiv gilt dann gemäß Gl. (10):

x = 550 nm/1,25 = 440 nm

So liebe Freunde der Mikrokristalle, nach soviel Rechnerei jetzt noch einige Mikrofotos. Es ist immer noch Spargelzeit. Darum habe ich mit das Asparagin vorgenommen. Wer nicht nur an den schönen Farben der Kristalle interessiert ist, sondern auch an deren Formen, dem kann ich das Asparagin sehr ans Herz legen. Man erhält mit dieser Substanz häufig sehr schöne Einzelkristalle, wie die folgenden Bilder zeigen:

Asparagin 100x fotografiert im polarisierten Licht.

 

 

Asparagin 100x fotografiert im polarisierten Licht.

 

Für die Aufnahmen wurden 260 mg Asparagin in einer Lösung aus 8 ml dest. Wasser und 4 ml Propanol-2 heiß gelöst.

Soviel für heute, liebe Freunde der Mikrokristalle. Das Thema Auflösungsvermögen mikroskopischer Objektive ergänze ich in meinem nächsten Blogbeitrag noch mit einem etwas anderen Zugang als dem von Ernst Abbe.

Bis dahin wünsche ich eine gute Zeit.

 

H-D-S

 

 

 

 

 

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L-Asparagin und L-Asparaginsäure: Spargelinhaltsstoffe für tolle Mikrokristalle

Hallo liebe Freunde der Mikrokristalle,

es ist Spargelzeit, eine gute Gelegenheit, sich dem L-Asparagin und der L-Asparaginsäure zu widmen. Beide Aminosäuren kommen, wie schon der Name sagt, im Spargel vor. Das L-Asparagin war die erste Aminosäure die entdeckt wurde. Es war, wie so oft, der Zufall im Spiel. Der französische Professor Louis-Nicolas Vauquelin fand zusammen mit seinem Studenten Pierre -Jean Robquet 1805 in einer eingedickten Lösung von Spargelsaft Kristalle, die sie Asparagin nannten. Hier die chemische Formel:

L-Asparagin

L-Asparagin

Das mit dem roten Stern gekennzeichnete Kohlenstoffatom ist, wie man sieht, asymmetrisch. Es gibt also zwei im räumlichen Aufbau unterschiedliche Formen des Asparagins, (Stereoisomere oder Enantiomere) die daher auch optisch aktiv sind. (Informationen zur optischen Aktivität und zu asymmetrischen Kohlenstoffatomen findet man in meinem Blogbeitrag zur Weinsäure. Hier gibt es auch Hinweise, wofür das „L“ steht). Ersetzt man beim Asparagin die Amidgruppe (-CONH2) durch eine Carboxylgruppe (-COOH), so erhält man die Asparaginsäure.

L-Asparaginsäure

L-Asparaginsäure

Auch sie besitzt ein asymmetrisches Kohlenstoffatom und ist somit auch optisch aktiv. Beide Aminosäuren wird uns ein freundlicher Apotheker verkaufen oder beschaffen können. Für die Mikrofotos habe ich jeweils die L-Aminosäuren verwendet. Dieses sind auch die in der Natur vorkommenden Formen. Alle Proteine (Eiweißstoffe) des Menschen sind aus nur 20 Aminosäuren aufgebaut, eine davon ist die L-Asparaginsäure.

Sowohl das L-Asparagin, als auch die L-Asparaginsäure  lösen sich gut in heißem Wasser. In Spiritus sind sie nur sehr wenig löslich. Aus Schmelzen kann man keine Kristalle auf dem Objektträger gewinnen, da beide Verbindungen erst bei sehr hoher Temperatur schmelzen und sich dabei zersetzen. Woran liegt das? Beide Stoffe sind Zwitter. Schaut man sich die Moleküle an, so sieht man, daß sie sowohl eine bzw. bei der L-Asparaginsäure 2 Carboxylgruppen und jeweils eine Aminogruppe besitzen. Sie sind also zugleich Säuren und Basen. Bringt man Säuren und Basen zusammen, so bilden sie Salze. Wenn ein Molekül sowohl  saure als auch basische Eigenschaften besitzt, kann es ein inneres Salz bilden. Das ist bei der L-Asparaginsäure und dem L-Asparagin der Fall. Das erklärt auch die schlechte Löslichkeit in Spiritus und anderen organischen Lösungsmitteln. Und als Salze besitzen beide Verbindungen auch einen hohen Schmelzpunkt.

Wir müssen uns also auf das Kristallisieren aus wässriger Lösung beschränken. Beide Verbindungen bilden aber sehr schöne farbige Kristalle. Bringt man in einem Becherglas 250 mg L-Asparagin oder L-Asparaginsäure in 15 ml dest. Wasser zum Sieden, erhält man eine klare Lösung, von der man sofort einen Tropfen auf einen Objektträger gibt und an einem staubfreien Ort ohne Deckglas eintrocknen läßt. Beide Säure beginnen schon nach einigen Minuten zu kristallisieren.

Wer kein hitzebeständiges Becherglas besitzt kann auch Wasser in einem Wassererhitzer zum Sieden bringen und eine gute Teelöffelspitze L-Asparagin oder L-Asparaginsäure in einer kleinen Tasse oder einem kleinen Plastikgefäß mit ca. 15 ml Wasser (1/2 Schnapsglas) übergießen und mit dem Stiel eines Teelöffels gut umrühren. Davon je einen Tropfen auf einen Objektträger geben. Erfolgt die Kristallisation zu schnell, muß man etwas mehr Wasser nehmen, oder auch den Objektträger vorher vorsichtig auf einer Herdplatte erwärmen. (Nicht mit der Hand anfassen sondern mit dem Teelöffel von der Herdplatte schieben!). Sehr schöne Resultate erhält man, wenn man mit 1/3 Spiritus und 2/3 dest. Wasser als Lösungsmittel arbeitet. Die Lösung verteilt sich besser auf dem Objektträger. (Achtung! Spiritus ist sehr feuergefährlich. Niemals mit offener Flamme arbeiten!). Beim Erhitzen von Wasser im Becherglas beständig umrühren und Schutzbrille tragen. Rührt man beim Erhitzen nicht beständig, kann es zu einem Siedeverzug kommen, und das Wasser spritzt explosionsartig aus dem Becherglas. Also, immer eine Schutzbrille tragen.

Jetzt ein paar Fotos, die wie beschrieben, bei 100x Vergrößerung entstanden sind:

 

Asparaginsäure_blog_01

L-Asparaginsäure fotografiert unter dem Mikroskop im polarisierten Licht. Vergrößerung 100x

 

Asparaginsäure_02

L-Asparaginsäure fotografiert unter dem Mikroskop im polarisierten Licht. Vergrößerung 100x

 

Asparagin_01

L-Asparagin fotografiert unter dem Mikroskop im polarisierten Licht. Vergrößerung 100x

 

Asparagin_02

L-Asparagin fotografiert unter dem Mikroskop im polarisierten Licht. Vergrößerung 100x

 

Asparagin_03

L-Asparagin fotografiert unter dem Mikroskop im polarisierten Licht. Vergrößerung 100x

Versucht man die Säuren auf dem Objektträger aufzuschmelzen, zersetzen sie sich, wie schon ausgeführt. Dabei entstehen Blasen von Kohlendioxid. Das kann auch interessante Fotos geben, wie das folgende Beispiel zeigt:

 

Asparaginsäure_zersetzt

CO2-Blasen von zersetzter L-Asparaginsäure.

Soviel für heute, liebe Freunde der Mikrokristalle.

In meinem nächsten Blogbeitrag werde ich der Frage nachgehen, ob man die Schmelzpunkte des L-Asparagins und der L-Asparaginsäure durch bestimmte Maßnahmen herabsetzen kann, um die Zersetzung beim Aufschmelzen zu verhindern.

Bis dahin wünsche ich eine gute Zeit und viel Spaß beim Experimentieren mit dem L-Asparagin und der L-Asparaginsäure.

H-D-S